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血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展
日期：2011-08-08 00:00:00
摘要 在肾小球滤过功能试验中，血清肌酐、尿素及内生肌酐清除率是最常用的指标。由于以上指标尚存诸多不足，故人们一直在寻找新的反映肾小球滤过率变化的指标。胱抑素C是一种低分子量拼搏体育体育官网质，是半胱氨酸拼搏体育体育官网酶抑制物超家族的成员之一，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物。血清胱抑素C浓度在作为肾功能试验时优于血清肌酐浓度。至于胱抑素C测定的方法学，已有快速、简便且可自动化的“颗粒加强免疫比浊法”的最新报道，使血清胱抑素C测定的广泛临床应用成为可能。
关键词：胱抑素C；肾功能试验；GFR；肌酐
胱抑素C（Cystatin c）是一种低分子量拼搏体育体育官网质，Grubb等首先报道其血清浓度与GFR密切相关，可作为肾小球滤过功能指标[1]。近年来有关胱抑素C测定的临床应用及方法报道日渐增多，本文就胱抑素C的结构与功能，作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物及方法学进展作一综述。
1 胱抑素C的结构与功能
胱抑素C，以前也被称为γ-微量拼搏体育体育官网及γ-后球拼搏体育体育官网，是一种低分子量、碱性非糖化拼搏体育体育官网质，分子量为13KDa,由120个氨基酸残基组成，是一种分泌性拼搏体育体育官网质。细胞先合成一个带信号肽的前体拼搏体育体育官网，编码胱抑素C的基因位于人类第20号染色体，大约为4.3Kb，包含3个外显子，基因上游45-50核苷酸处为“TATA盒样”序列（ATAAAA）。胱抑素C基因5′-侧翼区GC含量较高，转录起始位点上游400bp序列的G+C＞70%，富含GC的“岛”也包括外显子1及内含子1、5′侧的一部分，整个富含GC“岛”约900bp，G+C含量为73%。此区域CpG/GpC比值接近于1，因此此区CpG是非甲基化的。在胱抑素C基因5′侧翼1Kb序列中发现了2个“GC盒”（GGGCGG），此区也发现了增强子核心样序列（GTGGAAGG）。由以上可见，胱抑素C基因5′侧翼序列与“看家基因”的启动子区具有相同的特性，即缺乏典型的“CAAT盒”、富含GC、有与转录因子Spl结合的“GC盒”。故可将胱抑素C基因看作是“看家基因”（house-keeping gene），即此基因在所有组织恒定持续地转录及表达。Northernx印迹也发现胱抑素C基因在所有的被观察的组织均表达，包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘[2]。
由于胱抑素C是一种分泌性拼搏体育体育官网质，故广泛地存在于各种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精浆等。至于胱抑素C的确切生物学功能目前还了解不多，研究发现胱抑素C是半胱氨酸拼搏体育体育官网酶抑制物超家族的成员之一，是目前发现的对组织拼搏体育体育官网酶B抑制作用最强的抑制物，对木瓜拼搏体育体育官网酶、无花果拼搏体育体育官网酶、组织拼搏体育体育官网酶H及L也有抑制作用，故胱抑素C的一个生理学功能可能是调节半胱氨酸拼搏体育体育官网酶的活性。胱抑素C基因突变可导致遗传性胱抑素C淀粉样血管病（HCCAA），可发生脑动脉血管破裂，这是目前发现的直接与胱抑素C相关的临床疾病。
2 胱抑素C作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物
由于胱抑素C基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故机体胱抑素C产生率相当恒定。因胱抑素C是一种低分子量拼搏体育体育官网质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由GFR决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。
grubb及Simonsen等[1]首先研究了血中低分子量拼搏体育体育官网质（β2-微球拼搏体育体育官网、视黄醇结合拼搏体育体育官网、胱抑素C）浓度与GFR（51Cr-EDTA清除率）的相关性，发现血清胱抑素C、β2-微球拼搏体育体育官网及视黄醇结合拼搏体育体育官网浓度的倒数与GFR的相关系数γ分别为0.75、0.70及0.39，血清肌酐浓度倒数与GFR的相关系数γ为0.73。可见胱抑素C是低分子量拼搏体育体育官网质中与GFR最相关的内源性标志物，甚至优于血清肌酐。血清β2-微球拼搏体育体育官网浓度由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也可升高，故不是理想的GFR内源性标志物，视黄醇结合拼搏体育体育官网的代谢十分复杂，且部分与前白拼搏体育体育官网结合，不能自由经肾小球滤过，故血清视黄醇结合拼搏体育体育官网浓度的倒数与GFR相关性最差，不能作为GFR的内源性标志物。胱抑素C即使在炎症状态下，其产生率也不会改变，血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。Pergande等用99mTc-DTPA清除率作为肾小球滤过功能的“金标准”（＜1.36ml/s为肾小球滤过功能受损，分析了胱抑素C、β2-微球拼搏体育体育官网及肌酐的血清浓度的诊断敏感性，结果发现它们诊断肾功能异常的敏感性分别为88.2%、64.7%及52.9%[3，4]。随后Newman报道[5]血清胱抑素C、肌酐浓度诊断异常GFR的敏感性分别为78.1%及57.1%，各自浓度倒数与GFR（51Cr-EDTA清除率）的相关系数分别为：0.81、0.50。Kyhse andersen[6]及Filley[7]的最近临床应用也表明血清胱抑素C浓度与GFR的相关性优于血清肌酐浓度。ROC（Receiver operating Characteristic）作图分析发现，通过改变“分割限”（cutoff limit）使胱抑素C的诊断敏感性下降至70%时，其诊断特异性仍可达75%；而通过改变血清肌酐浓度的“分割限”，使其诊断敏感性下降至50%时，才能获得100%的特异性，使敏感性增加至100%时，其特异性接近于零。各自ROC曲线下面积相差显著（P＜0.001），说明胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。
表1 各种测定方法比较
|
方法 |
检测限μg/L |
CV% |
测定时间 |
参考范围x±SD（范围），mg/L |
分析样品数 |
|
RID |
300 |
11 |
38h |
1.3±0.26(0.72～1.7) |
46 |
|
EIA |
30 |
10 ～12 |
16h |
1.1±0.42(0.63～2.5) |
30 |
|
RIA |
1.3 |
n.d. |
16～21h |
0.96±0.20(0.6～1.7) |
100 |
|
FIA |
1 |
n.d. |
lor3h |
n.d. |
|
|
EIA |
|
n.d. |
4.5h |
1.1±0.15 |
20 |
|
EIA |
1.9 |
4～5 |
5h |
0.75±0.65(≤20岁) |
85 |
|
1.34±0.95(＞20岁) |
189 | ||||
|
0.195 |
4～8 |
1.5h |
1.25±0.22(0.86～1.7) |
50 | |
|
EIA |
0.9 |
3～9 |
2h |
1.78±0.26(女) |
33 |
|
2.14±0.31(男) |
33 | ||||
|
PETIAm |
150 |
2.0～3.2 |
7min |
(0.61±1.21) |
27 |
|
PETIA |
27 |
3～5 |
5min |
＜1.25 |
|
|
PENIA |
170 |
3～5 |
6min |
(0.64～1.04) |
30 |
3 血清胱抑素C测定的方法学
由于血清中胱抑素C浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。Lofberg等首先用单向免疫扩散法（RID）及酶免疫测定法（EIA）对胱抑素C含量进行测定，按照目前的标准，当时报道的这两种方法不仅费时，而且检测限也差（分别为300，30μg/L）。随后，又有较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定（RIA、FIA及EIA）的方法报道，以改善胱抑素C测定的可靠性。 1993年Pergande等[3]报道了一种夹心酶免疫测定方法，其检测限虽然很低（0.9μg/L），但测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。以上各种测定方法均属非均相测定方法，很难自动化，因此限制了胱抑素C的广泛临床应用。胶乳免疫测定是一种均相测定方法，在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，此方法很容易自动化。Kabanda等于1994年报道的测定胱抑素C的胶乳颗粒凝集法是一种颗粒计数免疫测定法[8]。Kyhse andersen等[6]于同年报道了一种颗粒增强透射免疫比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA），使胱抑素C测定的时间缩短至5min左右，且可在自动生化分析仪上进行，使胱抑素C测定的常规应用成为可能。随后，Newman等也报道了类似方法[9]。1997年，Finney等报道了一种能快速自动测定胱抑素C的颗粒增强散射免疫比浊法（particle-enhanced nephelometric immunoassay, PENIA），其测定结果与PETIA法相关性良好[10]。各种胱抑素C测定方法的比较见表1。
从表1可见，单纯就检测灵敏度而言，RID法最差，而EIA、RIA及FIA法[11～14]均优于PETIA及PENIA法。由于RIA法存在放射性污染，FIA法需昂贵的仪器，以及RIA、FIA、EIA法测定时间长，且不能全自动化，无法用于临床大批量标本的测定。PETIA及PENIA法虽然检测灵敏度差些，但仍可达150μg/L左右，远远低于健康人血清胱抑素C浓度的下限值，可满足临床需要；这两种测定方法基本上不受血红拼搏体育体育官网、胆红素、类风湿因子、甘油三酯的影响，回收率可达95%～109%，批内及批间变异系数均较小（＜4.5%）；加上这两种方法可全自动化，故在血清胱抑素C测定的常规临床应用中可首选PETIA或PENIA法。
各位研究者所报道的血清胱抑素C浓度的参考范围有一定的差异，这一方面是由测定方法不同所致，另一方面与所用胱抑素C标准品的来源不同有关，现应用的胱抑素C标准品有3种类型：①从人尿中纯化的胱抑素C；②纯化的人类胱抑素C，并用重组胱抑素C定值；③重组胱抑素C，并溶于马血清。Pergande等用一种尿拼搏体育体育官网标准品，发现血清胱抑素C浓度存在性别差异，其它研究者利用其它标准品时未发现性别差异。因此，应制定有关标准品制备的统一标准，以便进行方法比较及参考范围的建立。
4 小结
在肾脏疾病治疗中已涌现出许多新方法，如抗炎药物、肾移植及透析等。在应用这些方法的过程中，肾移植后排斥反应的监测及肾毒性药物肾毒性监测等。均需一种快速、简单且能准确地反映GFR变化的指标[15]。无论从理论上还是实践中，血清胱抑素C的测定均优于血清肌酐的测定，加上能自动化的检测的PETIA及PENIA方法的建立，已使胱抑素C的广泛临床应用成为可能。在今后的实践中，应注意测定方法的标准化问题；观察血清胱抑素C浓度在不同肾脏疾病状态下的变化规律；应在更大的人群内测定血清胱抑素C浓度，以分析是否存在年龄及性别相关的差异；从而最终确定胱抑素C的敏感性及特异性。
参考文献（省略）
转摘！
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